细胞周期检测

细胞周期

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等。

一、BrdU法

1、原理

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

细胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小时）

2、仪器、用品与试剂 

2.1、仪器、用品：同常规细胞培养

2.2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

3、操作步骤 

3.1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。

3.2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3.3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

3.4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。

3.5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

3.6、弃去2×SSC液，流水冲洗。

3.7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

3.8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

3.9、计算：

2×SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠·2H₂ O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

附：BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

二、PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。

3、细胞染色

离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响） 。

4、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。