组织/细胞样本处理

一、ELISA 实验中血清的采集、处理和保存

       1、 真空采血针采集 2 ml 新鲜血液，加入无菌试管中

       2、 采血后室温静置 1 小时

       3、 将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 10 min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉 淀。

       4、 取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       5、 根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。 大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有含有内源性过氧化物酶，也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜 时检测。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加深。

二、ELISA 实验中血浆的采集、处理和保存

       1、 真空采血针采集 2 ml 新鲜血液，加入无菌试管中

       2、 按 1:9 加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠），30 分钟内于冰上分离血浆以 减少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）

       3、 将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 5 min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

       4、 取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       5、 根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。 请注意指标说明书上对于抗 凝血剂是否有特殊要求，建议使用 EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。 注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂 EDTA, 抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。

三、ELISA 实验中尿液的采集、处理和保存

       1、 采集尿液样本 500ul，加入无菌试管中

       2、 将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 10 min，，将离心好的样本留上清，弃下面沉 淀。 

       3、 取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       4、 根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

四、ELISA 实验中脑脊液的采集、处理和保存

       1、采集脑脊液样本，加入无菌试管中

       2、将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 10 min，，将离心好的样本留上清，弃下面沉淀。

       3、取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       4、根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

五、ELISA 实验中细胞上清液的采集、处理和保存

       1、采集细胞培养上清液 500ul，加入无菌试管中

       2、将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 10 min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

       3、取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       4、根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

六、ELISA 实验中细胞裂解液的采集、处理和保存（需要测蛋白浓度）

       1、 取细胞培养板或细胞悬液，用 PBS（PH7.2-7.4）洗涤细胞培养板 1-2 次。

       2、 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂（裂解液），使细胞破坏并放出细胞内成份。

       3、 将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 20 min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉 淀。

       4、 取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       5、 根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

七、ELISA 实验中肺泡灌洗液的采集、处理和保存

       1、 10% 水合氯醛溶液，腹腔麻醉。

       2、 打开腹腔，另取 10 ml 注射器行下腔静脉采血，尽可能将血放尽。

       3、 在冰面上对左肺进行肺灌洗。取 37℃ 生理盐水 5 ml，分三次灌洗：2 ml、1.5 ml、1.5 ml 灌洗。回收率在 70% 以上。

       4、 将肺泡灌洗液用离心机 4℃，1500rpm 离心 10 min。

       5、 取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       6、 根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定

八、ELISA 实验中关节滑液的采集、处理和保存

       1、 口腔关节：患者取坐位，常规消毒后，作皮下及关节后区局部浸润麻醉。

       然后嘱患者大 张口，采用装有 2 ml 生理盐水的注射器（5 号针头）作关节上腔 穿刺，髁后进针，针尖方向斜向前、内、上，抵达关节结节后斜面后稍后退，回抽如发现有淡黄色液体，即表明已进入关节上腔，注入 2 ml 生理盐水，反复注入、 回抽五次。 膝骨关节滑液：无菌穿刺取得关节液

       2、 将关节液用离心机 4℃，1500rpm 离心 15 min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀

       3、 取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       4、 根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

九、 ELISA 实验中各类组织匀浆的采集、处理和保存（需要测蛋白 浓度）

       1、 采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除附属的结缔组 织，称取组织块。

       2、 用移液管量取 0.1M PBS 或者用 0.86％ 冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应 该是组织块重量的 9 倍，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织 的小烧杯放入冰水中）。

       3、 匀浆的方式有多种：

       a) 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水 冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

       b) 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％ 组织匀浆，也可用 内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

       4、 将制备好的 10％ 匀浆用离心机 4℃，3000rpm 离心 15 min，将离心好的匀浆留上清，弃 下面沉淀。

       5、 取上清。 分装冻存备用， 2-8℃ 下，可放置保存 24-48 小时； -20℃ 下，可放置保存 1 个月； -70℃ 下，可放置保存 6 个月

       6、 根据实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。