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焦磷酸测序（Pyrosequencing）
焦磷酸测序技术是由4种酶（DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。
实验方法
1.甲基化处理
使用Qiagen EpiTect Bisulfite Kit试剂盒
步骤一：亚硫酸盐处理DNA
1.解冻DNA，Bisulfite Mix用800μl Rnase-Free水稀释，旋涡震荡，直到所有的Bisulfite Mix完全溶解（存放时间-20℃，4周）。如果需要可以加热溶液到60℃，而后震荡混匀；不要将已经溶解的Bisulfite Mix放在冰上。
2.用PCR管，准备经行亚硫酸盐反应，将DNA用Rnase-free水定容至20μl。反应体系如下：
DNA： 20μl
Bisulfite Mix： 85μl
DNA Protect Buffer： 35μl
Total： 140μl
3.在常温下，彻底混匀反应混合液，溶液会在DNA Protect Buffer加入后由绿色变成蓝色。
4.使用PCR仪经行眼硫酸盐反应（约5h）。反应程序如下：
95℃ 5min→60℃ 25min→95℃ 5min→60℃ 85min→95℃ 5min→60℃ 175min→20℃ Forever
步骤二：洗涤甲基化后DNA
1.使用掌上离心机离心PCR管，将反应后的溶液转入新的1.5ml离心管中。
2.向1.5ml离心管中加560μl现配的含有10μg/ml carrier的Buffer BL。旋涡混匀混合液后，离心。
3.将EpiTect Spin Colums吸附柱放在收集管上，将上一步所有的混合液体倒入EpiTect Spin Colums吸附柱中，最高速离心1min（12000rpm 1min），倒掉废液。
4.小心打开盖子，加入500µl Buffer BW ，最高速离心1min（12000rpm 1min），倒掉废液。
5.小心打开盖子，加入500µl Buffer BD ，盖上吸附柱盖子，常温放置15min，
（注意 ：勿将结晶倒入吸附柱；使用完BD后马上盖上盖子，避免长期暴露在空气中。）
6.最高速离心1min（12000rpm 1min），倒掉废液。
7.小心打开盖子，加入500µl Buffer BW ，最高速离心1min（12000rpm 1min），倒掉废液。
8.重复上一步。
9.将吸附柱套在一个新的2ml收集管中，最高速空管离心1min（12000rpm 1min）。
10.将EpiTect Spin Colums吸附柱置于新的1.5mL离心管中，打开盖子，56℃，孵育5min。
11.将EpiTect Spin Colums吸附柱置于新的1.5mL离心管中，在吸附柱中心加入20µl Buffer EB，15000×g 1min（12000rpm 1min）；再向吸附柱中加入20µl Buffer EB，15000×g 1min（12000rpm 1min）。
2.PCR
1引物设计： 所用软件：PyroMark Assay Design 2.0（具体见Primer.xlsx）
2引物合成方法：由上海祥音生物科技合成
3 PCR用到的试剂：KAPA2G Fast Multiplex Mix （Code NO.：KM5802）。
4 PCR的操作步骤：
PCR扩增体系：
KAPA2G Fast Multiplex Mix 12.5μL
Forward primer (10 Μm) 1μL
Reverse primer (10 Μm) 1μL
Template DNA 1μL
ddH2O 9.5μL
Total 25μL
PCR扩增程序
94 ℃ 5 min
94 ℃ 30 sec
56 ℃ 30 sec
72 ℃ 1min
72℃ 5 min
12℃ forever
3.Pyrosequencing检测
1. 在96孔PCR反应板中加入反应结合珠2 ul，结合缓冲液38ul，PCR产物40ul，室温下充分混匀10min。
2. 开启真空泵吸取结合珠及PCR产物混悬液，依次浸入70％ 乙醇，0.2M NaOH和冲洗缓冲液中各5 S;
3. 关闭真空泵,后将探头上结合珠及PCR产物置人40ul退火缓冲液(含测序引物1．5 ul)，85℃变性2 min，冷却至室温,使引物与模板退火杂交。
4. 根据Pyrose quencing软件序列设计信息所计算出剂量，在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及四种dNTP(QIAGEN)，
5. 将试剂舱及96孔反应板放入Pyrosequencing检测仪(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)进行反应，Pyro Q—CpG软件自动分析每个位点甲基化状态。
6. 样品编号为原始编号。
