重亚硫酸盐处理

亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

       如不特别指出，所用双蒸水（ddH2O）均经高压蒸汽灭菌。

       1、将约2μgDNA于1.5mlEP管中使用ddH2O稀释至50μl；

       2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

       3、42℃水浴30min；
以下步骤在水浴期间配制：

       4、10mM 对苯二酚（氢醌），加30μl至上述水浴后混合液中（溶液变成淡黄色）；

       5、3.6M 亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用ddH2O稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520μl至上述水浴后溶液中；

      6、EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；

      7、加200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；

      8、50℃避光水浴16h。

这一步需要注意的细节：

      1、基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4μg；

      2、所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确；

      3、亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收；

      4、水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。