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亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水(ddH2O)均经高压蒸汽灭菌。
1、将约2μgDNA于1.5mlEP管中使用ddH2O稀释至50μl;
2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;
3、42℃水浴30min;
以下步骤在水浴期间配制:
4、10mM 对苯二酚(氢醌),加30μl至上述水浴后混合液中(溶液变成淡黄色);
5、3.6M 亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用ddH2O稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520μl至上述水浴后溶液中;
6、EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液;
7、加200μl石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化;
8、50℃避光水浴16h。
这一步需要注意的细节:
1、基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4μg;
2、所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确;
3、亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收;
4、水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。