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一、标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10 ul
4种dNTP混合物 各200 umol/L
引物 各10~100 pmol
模板DNA 0.1~2 ug
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加双或三蒸水至 100 ul
二、PCR引物设计
1. 引物设计的基本原则
(1) 引物长度:15-30 bp,常用为20 bp左右。
(2) 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
(3) 引物内部不应出现互补序列。
(7) 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
2. 引物设计软件
三、模板的制备
(1)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。
(2)模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。(3)标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
四、PCR反应条件的控制
1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5 mmol/L。
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
5. 引物 浓度一般为0.1 ~0.5 umol/L。
6. 反应温度
(1)变性温度和时间95℃,30 s。
(2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。
(3)延伸温度和时间72℃,1 min/kb(10 kb内)。
(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)
五、PCR的循环参数
1. 预变性(Initial denaturation)
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。
3. 引物退火(Primer annealing)
退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp
5. 循环数
大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸
在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。
六、PCR步骤
1. DNA变性
(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA。
2. 退火
(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3. 延伸
(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。
七、PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。
实验流程及案例展示
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