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PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
1. 引物设计的基本原则
(1) 引物长度:15-30 bp,常用为20 bp左右。
(2) 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
(3) 引物内部不应出现互补序列。
1. 引物设计的基本原则
(1) 引物长度:15-30 bp,常用为20 bp左右。
(2) 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
(3) 引物内部不应出现互补序列。
(4)两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
(5) 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
(6)引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。
(7) 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
2. 引物设计软件
Primer Premier5.0 (自动搜索)*、Oligo6 (引物评价)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在线服务)。