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实验步骤:
一、准备工作
1、实验器具与材料:
(1)移液枪:200ul、10ul
(2)吸头:200ul、20ul
(3)EP管1。5ml、100ul
(4)水浴箱
2、实验器具的处理与准备
塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
3、试剂配制和准备:
(1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1。5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)RT中所需要的各种试剂
(3)引物浓度计算方法:(新合成的引物的稀释)假如终浓度为XuM(pmol/ul)加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)
二、RT时注意事项:
三、RT步骤
(一)用SSⅢ逆转录酶进行RT(20ul体积)
1、准备0、65ml的EP管
2、冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暂离心。
3、65℃水浴5分钟后,立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4、短暂离心后,冰上操作:加入4ul5×First-StrandBuffer,1ul0.1MDTT,1ulRNAse Inhibitor,1ulSSⅢ逆转录酶。
5、短暂离心
6、50℃水浴60分钟进行逆转录。
7、70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8、-20℃保存,或立即进行PCR。
(二)用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)
1、准备0.65mlEP管
2、加入4.5ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA
3、稍离心,100℃沸水裕1min
4、加入0.5uldNTP,2ul5×Buffer,1ulAMV逆转录酶
5、稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT
6、100℃沸水裕3min灭活AMV
7、立即PCR或-20℃保存。