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RNA提取的一般步骤是:破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA
破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。
沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc(pH-5.2)或异丙醇。
洗涤RNA使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。
融解RNA一般使用TE。
保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12,000×g离心5分钟。
破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。
沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc(pH-5.2)或异丙醇。
洗涤RNA使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。
融解RNA一般使用TE。
保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12,000×g离心5分钟。