免疫电镜包埋

        该项技术是组织样品经低温脱水渗透LR White树脂低温聚合包埋，超薄切片70-80nm，用特异性一抗与待检测抗原结合然后用带有胶体金标记的二抗与一抗抗原复合物结合，在电子显微镜下观察，由于二抗上的胶体金形成一定的电子密度而精确指示出相应抗原在亚细胞水平上的定位。

样本准备：

       组织取下后立即投入免疫电镜专用固定液，4°保存，4°冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。样品固定后应尽快安排做后续包埋和免疫标记实验，减少抗原丢失的可能性。

注意事项：

1、1-3min内取样，取样组织1mm³大小。取材前可提前准备装有免疫电镜固定液A液的培养皿，将小组织块离体取下后立即投入培养皿内，用手术刀在培养皿的固定液中进行切割成1mm³的小组织块。再将切割好的小组织块转移至装有新的免疫电镜固定液的EP管内继续固定。

2、取材时尽量精确到需要观察的目的部位（如观察肾小球取肾皮质；观察胰岛取胰岛丰富的胰尾；皮肤，肠胃等在固定液中易打卷的组织可将组织粘在滤纸上进行固定）。

3、取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织。

实验步骤：

1、取材固定

组织：新鲜组织确定取材部位，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，1-3min内取样，取样组织1mm³大小。取材前可提前准备装有免疫电镜固定液的培养皿，将小组织块离体取下后立即投入培养皿内，用手术刀在培养皿的固定液中进行切割成1mm³的小组织块。再将切割好的小组织块转移至装有新的免疫电镜固定液的EP管内继续固定，4℃固定保存及运输。

细胞、细菌：离心收集细胞或细菌沉淀，要求沉淀最少绿豆大小。加入免疫电镜专用固定液重悬混匀固定，4℃固定保存及运输。

2、清洗

组织：用4℃预冷的0.1M磷酸缓冲液PB（pH7.4）在冰盒上漂洗3次，每次10min。

细胞、细菌：细胞或细菌用高速冷冻离心机4℃离心，弃上清加入4℃预冷的0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4），混匀漂洗3min后再离心，重复洗涤3次。提前加热溶解制备2%琼脂糖溶液，待冷却至40℃左右后加入EP管内，在琼脂糖凝固之前将沉淀用镊子挑起悬浮包裹于琼脂糖内。在第一次漂洗时，可加入微量品红染液，使细胞着色，有利于后续切片定位。

3、脱水：预冷后的梯度酒精进行脱水，依次为30%酒精4℃ 20min，50%酒精-20℃ 20min，70%酒精-20℃ 20min，80%酒精-20℃10min，85%酒精-20℃ 10min，90%酒精-20℃ 10min，95%酒精-20℃ 10min，100%酒精-20℃ 10min，100%酒精-20℃ 10min。

4、树脂渗透：100%酒精：纯树脂=2:1 4℃ 1h；100%酒精：纯树脂=1:1 4℃ 3h；100%酒精：纯树脂=1:2 4℃ 17-20h；纯树脂 4℃ 17-20h；纯树脂 4℃ 2次，1h/次。

5、包埋：4℃，先将纯树脂滴入包埋胶囊中，然后将样本放入纯树脂中并扣上胶囊帽进行包埋，抽真空0.5h-1h后扣紧胶囊帽。

6、聚合：低温紫外聚合仪-20℃进行聚合48h以上，后恢复室温，取出树脂块备用。

效果展示：