原位杂交（FISH双标）

　　原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。

　　原位杂交(FISH双标)可以检测两个靶基因的共定位情况。

实验结果展示：

实验流程：

　　细胞爬片荧光探针原位杂交双标实验步骤

　　1、细胞爬片固定：细胞爬片置于4%多聚甲醛(DEPC)固定20min，于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

　　2、消化：基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml)消化8min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。.

　　3、预杂交：滴加预杂交液37°恒温箱1h。

　　4、杂交：倾去预杂交液，滴加含探针1杂交液，37度杂交过夜。

　　5、杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC 37°洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤

　　6、杂交：倾去预杂交液，滴加含探针2杂交液，37度杂交过夜。

　　7、DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。

　　8、镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm,发蓝光;FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光;CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。)

送样运输要求：

　　冰切：标本放原位杂交固定液中，常温运输;冰冻切片-20°运输。

　　石蜡：标本放原位杂交固定液中，常温运输;石蜡切片常温运输。

　　细胞爬片：细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后，密封，4度运输。共聚焦皿

　　新鲜组织：组织取出后可以立即冷冻处理，后干冰运输到武汉进行后续冰冻切片处理。新鲜组织-80°保存。