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免疫荧光技术原理与常见问题解析
来源:德尔夫生物 发布时间:2021-12-22
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
其原理就是将免疫学方法(抗原抗体特异性结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内的分布。荧光素受激发光的照射可以在显微镜下检出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),成像后可利用定量技术测定含量,从而对抗原进行细胞定性和定位分析。
有关免疫荧光的应用,列举了以下几项:
1、病原体检测;
2、自身抗体检测;
3、检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合物;鉴定肿瘤组织中的肿瘤相关抗原;
4、细胞表面抗原与受体检测:可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数;
5、将游离细胞作荧光抗体特异性染色后进行流式分析等。
实验虽小但需要注意的点很多,碰到问题的时候难免需要一一排查原因保证实验结果的严谨性,下面列举了一些常见的问题同各位分享~
常见问题一:无/弱染色
1、可能原因是烤片温度过高,推荐56℃-60℃1-2h;
2、检查一下一抗是否适用固定液和石蜡切片,使用浓度是否过低,孵育是否时间过短等。
常见问题二:非特异性背景染色
1、检查是否已灭活内源性过氧化物酶;
2、在孵育过程中干片;
3、抗原热修复过度。
常见问题三:染色过深
1、一抗浓度过高;
2、染色试剂浓度过高或孵育时间过长。