免疫荧光技术原理与常见问题解析

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

其原理就是将免疫学方法（抗原抗体特异性结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内的分布。荧光素受激发光的照射可以在显微镜下检出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），成像后可利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。

有关免疫荧光的应用，列举了以下几项：

1、病原体检测；

2、自身抗体检测；

3、检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合物；鉴定肿瘤组织中的肿瘤相关抗原；

4、细胞表面抗原与受体检测：可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数；

5、将游离细胞作荧光抗体特异性染色后进行流式分析等。

实验虽小但需要注意的点很多，碰到问题的时候难免需要一一排查原因保证实验结果的严谨性，下面列举了一些常见的问题同各位分享~

常见问题一：无/弱染色

1、可能原因是烤片温度过高，推荐56℃-60℃1-2h；

2、检查一下一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。

常见问题二：非特异性背景染色

1、检查是否已灭活内源性过氧化物酶；

2、在孵育过程中干片；

3、抗原热修复过度。

常见问题三：染色过深

1、一抗浓度过高；

2、染色试剂浓度过高或孵育时间过长。